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一、服務(wù)概述
        Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic RepeatsCRISPR)是細菌和古細菌為應對病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來(lái)的獲得性免疫防御機制,其中IICRISPR/Cas免疫系統依賴(lài)Cas9內切酶家族能夠靶向和剪切外源DNA,是目前使用最廣泛的CRISPR/Cas9系統。
        相對ZNF&TALEN編輯技術(shù),作為第三代基因編輯技術(shù)——CRISPR/Cas9系統具有顯著(zhù)優(yōu)勢。首先,載體構建簡(jiǎn)單且靶向效率高,只需要構建20堿基的CRISPR gRNA即可與DNA序列進(jìn)行匹配,從而介導Cas9蛋白對DNA序列進(jìn)行切割;其次,CRISPR-Cas9可編輯的位點(diǎn)分布頻率較高,易選擇合適的位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯;最重要的是,CRISPR-Cas9可同時(shí)對基因組進(jìn)行多位點(diǎn)編輯。CRISPR/Cas9系統因其系統成分簡(jiǎn)單、操作方便、突變效率高、成本低廉的優(yōu)點(diǎn),已成為現在發(fā)展最為迅速、國內外學(xué)者廣泛研究開(kāi)發(fā)、應用于多種生物體基因組的定向基因編輯技術(shù)。
        CRISPR/Cas9技術(shù)主要由兩個(gè)組成部分:內切核酸酶蛋白(endonuclease)和一段引導RNAguide RNA,gRNA)。內切核酸酶是來(lái)源于化膿性鏈球菌的Cas9核酸酶蛋白。 Cas9核酸酶具有切割雙鏈DNA的兩個(gè)DNA切割結構域(RuvC1HNH樣核酸酶結構域),能夠使DNA雙鏈斷裂。gRNA是改造后的單鏈嵌合RNA,將細菌tracrRNA的支架功能與細菌crRNA的特異性相結合。gRNA 5'末端的最后20bp作為靶向序列,通過(guò)RNA-DNA堿基配對將Cas9 / gRNA復合物特異性結合至基因組DNA靶點(diǎn),位于基因組DNA間隔區相鄰基序(PAM)的上游(圖1)。

1 CRISPR/Cas9基因敲除示意圖

        不同菌株類(lèi)型的CRISPR/Cas蛋白識別的PAM序列有所區別,化膿性鏈球菌Cas9的序列是5'-NGG。因此,我們所用的經(jīng)過(guò)改造的CRISPR/Cas9系統,可以針對任何5'-N20-NGG DNA序列并產(chǎn)生精確的雙鏈斷裂。然后通過(guò)細胞生物學(xué)中通用的DNA修復機制——非同源末端連接(NHEJ)或同源定向修復(HDR),來(lái)修復雙鏈斷裂的基因組DNA(圖2)。在修復過(guò)程中會(huì )產(chǎn)生一定數目的堿基缺失突變或堿基插入突變,而這些插入和缺失會(huì )造成基因的外顯子閱讀框的移碼或提前引入終止密碼子,導致無(wú)法轉錄為正確mRNA,沉默gRNA結合的靶基因。

2 CRISPR/Cas9系統沉默靶基因機制示意圖

 
二、服務(wù)內容
1. 設計gRNA靶向序列。
2. 構建含有gRNACRISPR/Cas9敲除質(zhì)粒,測序驗證產(chǎn)物。
3. 利用構建完成的CRISPR/Cas9敲除質(zhì)粒,包裝慢病毒并測定滴度。
4. 篩選獲得的基因敲除細胞株進(jìn)行T7E1驗證。
5. 基因敲除細胞單克隆化,擴大培養后進(jìn)行測序鑒定相應克隆,確認存在雙等位基因敲除。
6. 基因敲除細胞Western檢測驗證。
 
三、技術(shù)優(yōu)勢
1. 技術(shù)新:基于最新的CRISPR/Cas9技術(shù),有效敲除目的基因并避免脫靶效應。
2. 標準嚴:可以提供經(jīng)過(guò)T7E1法驗證的慢病毒或細胞株,也可以提供經(jīng)過(guò)Western blot驗證的多克隆細胞株。
3. 篩選快:基于CRISPR/Cas9技術(shù)的sgRNA快速篩選和驗證體系,可以在最短的時(shí)間內完成sgRNA的篩選和T7E1法驗證。
4. 時(shí)間短:目的基因敲除的多克隆細胞株僅需5-6周即可完成;單克隆細胞株一般在9-10周完成。
 
四、服務(wù)提供圖片(以MSTN基因敲除為例)
1gRNA靶向序列位置及相關(guān)參數。

MSTN基因gRNA序列(黑體)及PAM序列(下劃線(xiàn))

2)構建完成的質(zhì)粒圖譜。

質(zhì)粒構建過(guò)程

構建完成的MSTN基因CRISPR/Cas9敲除質(zhì)粒圖譜

3)篩選細胞株T7E1驗證結果
對敲除基因后的細胞的PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性和退火處理后加入T7E1 (核酸內切酶,只切割堿基錯配的DNA),經(jīng)T7E1消化后可見(jiàn)明顯的切割條帶,說(shuō)明預期的敲除位點(diǎn)附近存在大量gRNA引導Cas9切割形成的缺失突變。

MSTN基因敲除細胞株T7E1驗證結果

4)基因敲除細胞單克隆測序驗證結果。

MSTN基因敲除細胞株單克隆測序結果。

5)基因敲除細胞Western檢測驗證結果
        篩選獲得的陽(yáng)性細胞傳代2次后,取細胞制備蛋白樣品,每孔的蛋白上樣量為20-40μg。用GAPDH作為內參,用抗MSTN的抗體檢測細胞中MSTN蛋白表達情況。

MSTN基因敲除細胞中MSTN蛋白Western檢測結果

 
五、服務(wù)價(jià)格及周期

服務(wù)編號服務(wù)項目價(jià)格服務(wù)周期
RS002-1構建CRISPR/Cas9敲除質(zhì)粒,并完成測序驗證
2
RS002-2包裝慢病毒,并完成測定滴度驗證
2
RS002-3陽(yáng)性細胞篩選,并完成T7E1驗證
1
RS002-4單克隆化陽(yáng)性細胞,并完成測序驗證
3-4
RS002-5基因敲除細胞Western檢測驗證
2-3
RS002-6CRISPR/Cas9基因敲除用慢病毒(無(wú)T7E1驗證)
3-4
RS002-7CRISPR/Cas9基因敲除用慢病毒(T7E1驗證)
3-4
RS002-8CRISPR/Cas9基因敲除多克隆細胞株(T7E1驗證)
5-6
RS002-9CRISPR/Cas9基因敲除多克隆細胞株(T7E1驗證、WB驗證)
6-7
RS002-10CRISPR/Cas9基因敲除單克隆細胞株(單等位基因敲除)
9-10
RS002-11CRISPR/Cas9基因敲除單克隆細胞株(雙等位基因敲除)
9-10
RS002-12敲除用慢病毒與敲除多克隆細胞株
5-6
RS002-13相同基因敲除用慢病毒再次訂購
1-2
RS002-14相同基因敲除多克隆或單克隆細胞株再次訂購
1-2
RS002-15相同基因敲除的不同多克隆細胞株(T7E1驗證)
5-6
RS002-16相同基因敲除的不同多克隆細胞株(T7E1驗證、WB驗證)
5-6
RS002-17相同基因敲除的不同單克隆細胞株(單等位基因敲除)
9-10
RS002-18相同基因敲除的不同單克隆細胞株(雙等位基因敲除)
9-10
RS002-19其它CRISPR/Cas9相關(guān)技術(shù)服務(wù)詢(xún)價(jià)

 

 
六、CRISPR/Cas9技術(shù)服務(wù)流程
1. 用戶(hù)下載并填寫(xiě)CRISPR/Cas9技術(shù)服務(wù)協(xié)議書(shū),發(fā)送至service@morecell.com.cn。
2.  雙方確認并簽訂技術(shù)服務(wù)協(xié)議書(shū),按照協(xié)議內容進(jìn)行技術(shù)服務(wù)。
 
七、客戶(hù)須知
1. 客戶(hù)提供需要編輯的目的基因相關(guān)信息;
2. 客戶(hù)提供需要編輯的細胞株及其相關(guān)信息;
3. 客戶(hù)需要提供需要編輯目的基因的抗體(如果選做western);
4. 敲除用慢病毒將以干冰運輸的方式提供;
5. 基因敲除的細胞株將以干冰運輸或活細胞培養的方式提供。